Ich hatte am 15.02.2006, morgens um 9.00 Uhr, F1-Abschlusskolloquium bei
Professor Muller. Zu Beginn der Prüfung zog ich aus acht Karten, auf
denen die jeweiligen Versuche notiert waren, drei Karten - ich zog die Versuche
B2
(Kristallisation von Hühnereiweißlysozym), C2
(Rückfaltungsscreeens für Tyro3) und D1
(Strukturaufklärung einer Nitrogenase durch Molekularen Ersatz). Übrigens
- die Karten scheinen tatsächlich unsortiert zu sein, ich zog nämlich
einfach drei nebeneinander liegende und hatte keine aufeinanderfolgende Versuche.
Ich habe euch eine Liste der Fragen, an die ich mich erinnern kann, aufgeschrieben,
meist mit meinen Antworten dazu (von denen ich aber nicht garantiere, dass
sie vollständig sind!!!)
Versuch B2 (Kristallisation von Hühnereiweißlysozym)
- Was sind Proteinkristalle?
- hoch geordnete Proteinmoleküle in Kristallen, so wie z.B. Zuckerkristalle,
nur viel viel weicher und weniger stabil
- Wie nennt man diese hoch geordneten Strukturen?
- ich brauchte kurz, kam aber dann auf: Elementarzellen, erzählte
dann noch, dass es 65 Bio-Ordnungen gibt, die sich aus den 14 Bravaisgittern
und den 32 Punktgruppen zusammensetzen (was, wie er meinte, so gar nicht
unbedingt stimmt, wegen der möglichen Drehungen und so - aber da
sie das nicht so genau erklärt hatten, machte er sich wohl nur
eine geistige Notiz, das das nächste Mal deutlicher klarzustellen
und war zufrieden)
- Wie heißen diese 65 Ordnungen?
- Raumgruppen - war mir vorhin nicht gleich eingefallen
- Warum sind Proteinkristalle weich?
- einerseits, weil sie zu 50 % aus Lösungsmittel bestehen, andererseits,
weil Proteine unregelmäßig geformt sind, nicht so regelmäßig
wie z.B. Zuckermoleküle, und daher nicht so optimal stapelbar sind
- Wissen Sie, was die maximale Packung ist?
- Nein. Wusste ich nicht. Hatte ich in Chemie mal irgendwann gehört
- irgendwas mit "Kugelpackung", ich weiß es aber leider
schon nicht mehr genau
- Was meinten Sie mit "Lösungsmittel" - das klingt mir zu
chemisch.
- Ich sagte, das sei meist Wasser, es sei denn, es handle sich um hydrophobe
Proteine (die es, wie ich lernte, so gut wie nicht gibt, eigentlich
sind fast alle Proteine zum größten Teil hydrophil, selbst
Membranproteine, die ja zum größten Teil außerhalb
der Membran sind). Er fragte eine Weile am Wasser herum und sagte, er
sei damit unzufrieden, ich verstand gar nicht, worauf er rauswollte
- bis es mir wie Schuppen von den Augen fiel: Klar - Puffer!
- Warum halten Proteinkristalle nicht so gut zusammen?
- Sie sind nicht kubisch oder so, so dass man sie perfekt nebeneinander
packen könnte, sondern unregelmäßig und können
sich nur an wenigen Stellen berühren, so dass immer viel Platz
zwischen den Molekülen ist, in denen Lösungsmittel lagert.
Er: "Also wegen des Lösungsmittels?" Ich: "Äh,
ja, genau."
- Oft sagt man, in Kristallen lägen Proteine artifiziell vor - was
sagen Sie dazu?
- Man hat einige Strukturen sowohl mit NMR als auch mit Röntgenstrukuranalyse
von Kristallen gelöst und Übereinstimmung gefunden, was ein
deutlicher Hinweis ist, dass die Proteinkristalle "normale"
Proteine enthalten.
- Wie kann man überprüfen, ob das Protein im Kristall richtig
gefaltet ist?
- Tränken des Kristalls mit Stoffen, die Wechselwirkungen eingehen
oder binden, z.B. Cofaktoren oder Substraten (Solvenskanäle sind
oft groß genug)
- Warum funktioniert das praktisch mit Enzymen sehr oft nicht?
- Hier musste ich Vermutungen anstellen
- die Moleküle dringen nicht gut in den Kristall ein
- die Moleküle kommen nicht richtig rein, weil sie sich außen
schon anlagern und damit den Weg für andere Moleküle nach
innen versperren
- man kennt einfach das passende Molekül noch nicht (bei neu
aufgeklärten Strukturen, wenn man noch nicht weiß, welches
der Ligand o.ä. ist - fand er aber ein bisschen sehr konstruiert)
- die Bedingungen für die Bindung sind in der Umgebung, in
der der Kristall halbwegs stabil ist, nicht gut für die Bindung
- die Wechselwirkungen beeinflussen die Proteinstruktur, so dass
die Kristallkontakte verloren gehen
- worauf er wirklich raus wollte, war meinem letzten Punkt sehr ähnlich:
die Enzyme können ihre komplette Struktur verändern, wenn
sie an ein Substrat binden, Teile können vollständig umklappen
- wenn das nötig ist, dann geht das im Kristall einfach nicht
- Welche Parameter beeinflussen die Kristallisation von Proteinen?
- pH-Wert
- Temperatur
- Fällungsmittel
- Proteinkonzentration
- Additive
- Was für Fällungsmittel setzt man ein?
- Ionen - man beachtet beim Aussalzen die Hofmeisterreihe, die angibt,
wie löslich Ionen sind
- Was ist Aussalzen und wie funktioniert es?
- ich habe den Effekt der Konkurrenz der Ionen mit den Proteinen um
die Solvathülle beschrieben, dass das Wasser "hydrophober"
wird und sich die hydrophoben Seitenketten so besser lösen, das
Protein also löslicher wird
- Welche Ionen verwendet man am häufigsten zum Aussalzen?
- "(NH3)2SO4" - "Und wie heißt das?" - "Äh
... *denk* ... Ammonium...sulfat. Ammoniumsulfat!" (ich wusste
es echt kurzzeitig nicht mehr *g*)
- Wie beeinflusst denn das Fällungsmittel die Löslichkeit?
- Ich habe das berühmte Diagramm aus dem Skript gezeichnet, wobei
ich mich zuerst bei der Achsenbeschriftung vertan hatte - das Bild füg
ich hier noch ein
- Welche Methode zur Kristallisation haben Sie verwendet?
- Ich beschrieb die Hanging Drop-Methode, dass die Konzentration des
Fällungsmittels im Reservoir höher ist als im Tropfen, das
Wasser daher hin"diffundiert" (durch die Luft), dadurch die
Fällungsmittelkonzentration im Tropfen steigt, bis sich Kristallisationskeime
bilden können und die Proteinkonzentration durch die Kristallisation
sinkt, weswegen keine neuen Kristallisationskeime entstehen, sondern
die bestehenden in Ruhe weiterwachsen können ... na ja, ihr wisst
das ja alles aus dem Skript.
- Wie bewegen Sie sich im von Ihnen gezeichneten Diagramm, wenn Kristalle
entstehen? Warum?
- das mal ich hier mal auf, das kann ich so schlecht erklären
Versuch C2 (Rückfaltungsscreeens für Tyro3)
Vorab ein Hinweis: Ab hier sind meine Erinnerungen lückenhaft!
- Erzählen Sie mir bitte, was Sie im Versuch C2 gemacht haben
- Was war C2? Ich wusste es echt nicht mehr so genau, kam dann aber
drauf - merkt euch also am besten die Versuchsnummern dazu :-)
- Wie kann man überprüfen, ob ein Protein richtig gefaltet ist?
- Was für Chromatographieverfahren kennen Sie?
- Wie funktioniert die Ionenaustauschchromatographie?
- Wie sieht die Auswertung aus, die der Computer erstellt?
- Was ist der erste Peak?
Versuch D1
(Strukturaufklärung einer Nitrogenase durch Molekularen Ersatz)
- Was ist Molekularer Ersatz?
- Was beschreibt die "Schwärzungen"?
- Was sind die hkl-Werte?
- Beschreiben Sie das Phasenproblem.
- Was ist wichtiger, die Phase oder die Amplitude